過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)試劑盒(鉬酸銨比色法)說(shuō)明書(shū)
微量法100管/96樣
測定意義:
CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞中,是最主要的H2O2清除酶,在活性氧清除系統中具有重要作用。
測定原理:
過(guò)氧化氫能氧化MoO42-成MoO52-,MoO52-接受氫氧根的電子成鍵,分子間立即脫水縮合,得到穩定的黃色復合物(H2MoO4·XH2O)n在405nm處有強烈吸收峰,其吸光值和過(guò)氧化氫濃度成線(xiàn)性關(guān)系。測定出體系剩余過(guò)氧化氫在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。
需自備的儀器和用品:
酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑組成和配制:
提取液:液體100 mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體10 mL×1瓶,4℃避光保存;
試劑二:液體25 mL×1瓶,常溫保存;
試劑三:液體60 mL×1瓶,4℃保存;
粗酶液提?。?/span>
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬(wàn)細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g組織,加入1mL提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、 酶標儀預熱30min以上,調節波長(cháng)至405 nm。
2、在EP管中加入下列試劑
試劑名稱(chēng)(μL) | 測定管 | 空白管 |
樣本 | 10 | |
試劑一 | 60 | |
混勻,25℃準確反應2 min | ||
試劑二 | 200 | |
試劑三 | 530 | 530 |
試劑二 | 200 | |
提取液 | 10 | |
試劑一 | 60 | |
混勻,取200μL于96孔板立即測定A空白和A測定,ΔA=A空白-A測定。空白管只需做一管。 |
CAT活性計算:
1、標準曲線(xiàn):y = 0.09x + 0.0013 R2 = 1 x:體系中過(guò)氧化氫濃度變化值(μmol/mL)
y:吸光值差值ΔA
2、血清(漿)CAT活力的計算:
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷V樣÷T
=444.44×(ΔA-0.0013)
3、組織、細菌或細胞中CAT活力計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T
=444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化1μmol H2O2降解定義為一個(gè)酶活力單位。
CAT(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷(W× V樣÷V樣總)÷T
=444.44×(ΔA-0.0013)÷W
V反總:反應體系總體積,0.8 mL;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時(shí)間,2 min;W:樣本質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL。
注意事項:
1、 預實(shí)驗若發(fā)現酶活性過(guò)高(A測定<0.1),可用提取液適當稀釋樣品后測定,并在計算公式中乘以相應稀釋倍數。
2、 若A空白<A測定,一方面可能是酶活性過(guò)低,可將反應時(shí)間2延長(cháng)到5min,另一方面可能樣本中雜質(zhì)干擾嚴重,可將樣本稀釋5倍左右后測定,并在計算公式中代入實(shí)際反應時(shí)間和乘以相應稀釋倍數。
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